INVESTIGACIÓN CROMOSOMICA EN PEQUEÑOS ROEDORES

TÉCNICAS CITOGENETICAS:

Preparación de cromosomas :

Los cromosomas sólo son visibles y adecuados para un análisis de cromosomas clásico durante la metafase del ciclo celular. A medida que la metafase es muy corta, las células en un fuerte crecimiento son necesarias para prepararlos cromosomas para la observación microscópica.

Cultivo de linfocitos es el método más común para obtener muchas células en la metafase al mismo tiempo. Una tasa mitótico del 1 porciento es común en una cultura buena. Normalmente, los linfocitos son células inactivas, por lo tanto tienen que ser estimuladas para dividirse. El mitogene más comúnmente utilizados (agente estimulante de mitoses) es PHA (fitohemaglutinina), que es un extracto de fríjol.

Los procedimientos siguientes se utilizan para la 'cultura de sangre' y las preparaciones de cromosomas con el método del aire seco:

• Sangre estabilizada con heparina, que puede ser almacenada a temperatura ambiente (20 C⁰) en hasta cinco días antes del inicio del cultivo.
• 0,3-0,5 ml de sangre del total de 5 ml de medio de cultivo (RPMI) añadir un 10 porciento de suero bovino fetal y de PHA. Se cultiva durante 60 horas a 38 C⁰.
• Las dos últimas horas con añadido Colcemid (centrifugar y eliminar el sobrenadante = -----)
• Las células son tratadas en una solución salina de mitad fisiológica (0,075 M KCl) para 10 min. ---------
• Las células son tratadas con ácido fijador (metanol-acido acético 3:1), añadir lentamente mientras se agita vigorosamente, después de 15 min. ------------------- lentamente
• Lavar en nuevo fijador tres veces, cada vez mantenido las células en suspensión, cada vez --------------- lentamente
• Las células pueden ahora ser almacenada durante años antes de su uso a menos 20 C⁰.
• Dejar caer de suspensión de células en portaobjetos y dejar que se seque, mientras borrando el fijador excedente de los bordes de portaobjeto
• Coloración con Giemsa o otro colorante de núcleo
• Observación microscópica y foto
• 

También se pueden hacer Cromosomas a partir de cultivos de células de fibroblastos, que puede ser establecido a partir de un clip de oreja o el tejido muscular subcutáneo. Después de una autopsia, examen de los tejidos de los pulmones o los riñones también pueden utilizarse para establecer una cultura de células primarias. La cultura debe establecerse dentro del primer día después de haber obtenido la prueba. El cultivo celular se establece en un tubo Falcon mediante la adición de medios de crecer y algunos trozos de tejido, que han sido picados con tijera. Normalmente tiene que crecer más de 10 días antes de que se haya desarrollado una cantidad suficiente de células para preparaciones de cromosomas. Los medios de crecimiento son los mismos que se menciona en virtud de la 'cultura de sangre', pero aquí no hay que añadir PHA.

Para identificar los pares de cromosomas individuales es necesario de un coloración específica. Esto se hace por añadiendo un análogo de la timidina -Bromo-desoxi-uracilo (BrdU) a las células en crecimiento 6-7 horas antes de la cosecha, dependiendo de la tasa de crecimiento. Después de la coloración con Acridina naranja la incorporación de BrdU debería dar cromátidas débilmente coloreadas en las zonas que reproducirse después de la adición de BrdU. Considerando que el anterior áreas replicado dar un color brillante fuerte. Por medio de esta coloración del X cromosoma inactivo en la hembra normal puede ser demostrado, como el inactivo cromosoma X tiene una replicación muy tarde en el ciclo celular.

TECNICA CITOGENETICA PARA PEQUEÑOS ROEDORES:

Procedimiento Experimental. 
2.1 Sacrificio de los animales por dislocación cervical. 
2.2. Se aplica alcohol al 70 % a nivel de abdomen y extremidades inferiores. 
2.3 Con tijeras de iris, corte la piel que cubre el fémur, para dejarlo al descubierto. Con tijeras  
y pinzas de disección,  separar los músculos del hueso y seccionarlo por debajo de la rodilla y 
a nivel de la articulación de la cadera.  
2.4 Fracturar la rodilla, con un movimiento en  sentido contrario al de  la articulación. Esto 
permitirá desgarrar los músculos insertados y dejar el hueso al descubierto. 
2.5 Corte un extremo del fémur. 
2.6 Lave la cavidad del hueso con suero bovino  fetal (3 mL/animal). Para ello introduzca el 
fémur  en un tubo de ensayo conteniendo al menos 3 ml de una solución buffer fosfato a pH 
7,4 o suero bovino fetal y con una jeringuilla con aguja cargue el líquido, introduzca la aguja 
en la cavidad de la médula y  expulse gentilmente el contenido para lavar la cavidad (repetir 3 
veces). Nunca debe cargar la jeringuilla con la aguja dentro de la cavidad medular. 

Este procedimiento es común para la obtención de preparaciones citogenéticas de células en 
metafase: 
3.1 Centrifugar a 1 200 r.p.m. durante 10 minutos. 
3.2 Decantar el sobrenadante con ayuda de la pipeta, dejando aproximadamente 0.5 ml en el 
cual se incluyen restos del sobrenadante y el botón celular. 
3.3 Despegar las células del fondo del  tubo por discretos golpes. 
3.4 Adicionar gota a gota una pipeta completa de una solución hipotónica de KCl adelgazada, 
(0,075 Molar o al 28% (0,56 g en 200 ml de agua destilada), resuspender suavemente las 
células de 20-25 veces y luego enrasar a volumen 8, resuspender 10 veces, en ambas 
ocasiones con la ayuda del vortex a bajas revoluciones (10-15 Hz o 1200 r.p.m.) o con una 
pipeta pasteur. De indicarse otro agente a otra concentración en el protocolo, se hará lo 
que está descrito en éste. No abusar del uso del vortex.
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3.5 Incubar a 37ºC durante 20-40 minutos, este tiempo varía según las condiciones 
ambientales de cada laboratorio, en el nuestro lo hemos estandarizado de 30-35 minutos. 
3.6 Prefijar la muestra adicionando 6 gotas de la solución fijadora (metanol:ácido acético (3:1), 
frío), resuspender 5 veces sin ayuda del vortex.
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3.7 Reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. 
3.8 Repetir el paso 3.1 
3.9 Repetir el paso 3.2 y 3.3 
3.10 Fijar la muestra adicionando gota a gota la solución fijadora por las paredes del tubo 
llevándolo a 7 ml de volumen, resuspender 4 veces con la ayuda del vortex (10-15 Hz o 
1200 r.p.m.) y/o pipeta pasteur. 
3.11 Reposar a  temperatura ambiente durante 20 minutos. 
3.12 Repetir el paso 3.1 

3.13 Repetir el paso 3.2 y 3.3 
3.14 Adicionar la solución fijadora llevándolo a 5 ml de volumen, con ayuda del vortex (10-
15 Hz o 1200 r.p.m.) pero sin resuspender. 
3.15 Repetir el paso 3.1. 
3.16 Repetir el paso 3.2 y 3.3. 
3.17 Repetir el paso 3.14, pero llevándolo a  3 ml de volumen. 
3.18 Repetir el paso 3.1 
3.19 Repetir el paso 3.2 y 3.3. 
3.20 Resuspender de 3 a 4 veces con ayuda de la pipeta. 
3.21 Montar sobre portaobjetos húmedos extraídos del horno a una temperatura de 60-
70ºC, esperar de 5 a 6 minutos antes de ser usados para lograr un enfriamiento ligero. Se 
depositan de 2 a 3 gotas por lámina a una distancia de 30 a 45 cm entre la punta de la 
pipeta y la lámina a extender. 
3.22 Dejar secar al aire o a  temperatura  ambiente. Codificar con tabla de números 
aleatorios. 
3.23 Teñir con Giemsa al 10 % durante 10-15 minutos, bajo nuestras condiciones 
ambientales y materiales el tiempo puede variar desde 25-30 minutos. 
3.24 Montar con cubre objetos, sellando con bálsamo de Canadá.